꽃향유(Elsholtzia splendens)에서 Elsholtzia ketone과 Dehydroelsholtzia ketone의 생합성 경로에 관여하는 잠재적인 유전자 규명

심우현1*, 심상래1

(1강원대학교 산림과학부)

Identification of putative genes involved in the biosynthetic pathway of Elsholtzia ketone and Dehydroelsholtzia ketone in

Elsholtzia splendens

Woohyun Sim1*, Sangrea Shim1

(1Department of Forest Resources, Kangwon National University)

요약: Elsholtzia splendens는 독특한 향을 가지고 있는 식물로, 그 추출물은 항바이러스, 항염증, 항균, 항산화, 항암 등의 다양한 약리학적 특성을 나타낸다. E. splendens의 정유(essential oil)에는 두 가지 주요 화합물인 elsholtzia ketone (EK)과 dehydroelsholtzia ketone (DEK)이 포함되어 있는 것으로 밝혀졌음에도 불구하고, EK와 DEK의 생합성 경로는 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 이전 연구에서는 EK가 GPP (geranyl pyrophosphate)로부터 geraniol, geranial, neral, rosefuran과 같은 중간체를 거쳐 합성될 것이라고 제안된 바 있으나, 그 과정은 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구는 E. splendens 주요 화합물인 EK와 DEK의 생합성에 관여하는 잠재적 유전자를 탐색하기 위해 수행되었다. 이를 위해 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)을 이용해 EK와 DEK의 함량을 정량화한 결과, 꽃 조직에서 가장 높은 농도가 확인되었다. 또한, 꽃의 5단계 발달 시기(early flower bud, flower bud elongation, early flowering, mid-flowering, full bloom)를 비교한 결과, mid-flowering 단계에서 화합물 함량이 가장 높았으며, 꽃 조직이 성숙함에 따라 함량이 증가하는 경향을 보였다. 이에 따라 RNA-seq 기반 전사체 분석을 early flower bud 단계(가장 낮은 DEK 농도)와 full bloom 단계(두 번째로 높은 DEK 농도)에서 수행하였다. 그 결과 총 135.83 million reads가 생성되었으며, 전사체 조립을 통해 평균 길이 1,113.9 bp의 31,412개의 unigene이 확인되었다. 조립된 전사체를 기반으로 early flower bud와 full bloom 간의 차등 발현 유전자 (DEGs) 분석 결과, 총 4,878개의 유전자가 확인되었으며, 이 중 2,546개는 full bloom 단계에서 upregulation 되었고, 2,332개는 downregulation 되었다. Gene Ontology (GO) enrichment 분석에서는 full bloom 단계에서 "terpene catabolic" 및 "terpene metabolic"과 관련된 생물학적 과정이 유의미하게 풍부하다는 결과가 나타났다. 또한, KEGG 경로 분석에서는 full bloom 단계에서 terpenoid backbone biosynthesis pathway (No. ko00900)가 상향 조절되었음을 확인하였다. 이러한 분석 결과는 EK와 DEK의 생합성 경로에 관여하는 효소들이 full bloom 단계에서 상향 조절될 가능성이 있음을 시사하며, 이는 terpene 및 isoprenoid 합성 경로의 활성화와 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 선행연구에 따르면 CYP76 유전자 군이 furan ring synthase 및 monoterpenol 산화 과정에서 중요한 역할을 할 가능성이 제기되었다. 이에 따라 DEK와 rosefuran의 생합성과 관련된 잠재적 유전자를 확인하기 위해 CYP76 subfamily를 중심으로 phylogenetic 분석과 DEGs 분석을 수행하였다. 본 연구는 rosefuran과 dehydroelsholtzia ketone의 생합성과 관련되어 있는 후보 유전자를 선발할 수 있었으며, 이후에 진행될 (VIGS 또는 CRISPR Cas9 시스템 등을 활용한) 유전자 기능 검증을 통해 EK 생합성 과정을 분자 수준에서 규명할 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract: Elsholtzia splendens has aromatic value and exhibits various pharmacological properties, including antiviral, anti-inflammatory, antibacterial, antioxidant effects and antiproliferative activity against cancer cells. The essential oil of E. splendens consists of two major compounds: elsholtzia ketone (EK) and dehydroelsholtzia ketone (DEK). However, the biosynthetic pathways of EK and DEK remain largely unknown. Previous studies have suggested that EK is synthesized from GPP through a series of intermediates, including geraniol, geranial, neral, and rosefuran, yet the steps involved in its synthesis are not well understood. This study aims to investigate potential genes involved in the biosynthesis of the main compounds of E. splendens. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis was performed to quantify the EK and DEK, indicating that the flower tissues contained the highest concentrations. Furthermore, comparisons across five developmental stages of flowers (early flower bud, flower bud elongation, early flowering, mid-flowering, full bloom) demonstrated that compound levels were highest during the mid-flowering stage, with a general trend of increasing levels as flower tissues matured. Therefore, transcriptomic analysis was conducted using RNA-seq on samples from the early flower bud and full-bloom stages, which exhibited the lowest and second-highest levels of DEK, respectively. RNA sequencing yielded a total of 135.83 million reads, and the transcriptome analysis identified 31,412 unigenes with an average length of 1,113.9 bp. Differentially expressed genes (DEGs) analysis between the early flower bud and full-bloom stages identified a total of 4,878 genes, of which 2,546 were upregulated and 2,332 were downregulated in full-bloom stage. Gene Ontology (GO) enrichment analysis indicated significant enrichment of terms related to "terpene catabolic" and "terpene metabolic" biological processes in the full-bloom stage compared to the early flower bud stage. Furthermore, KEGG pathway analysis confirmed the upregulation of the terpenoid backbone biosynthesis pathway (No. ko00900) in the full-bloom stage compared to the early flower bud stage. These analyses indicate that enzymes involved in the EK and DEK biosynthetic pathways may be upregulated in the full-bloom stage, possibly through upregulation of the terpene and isoprenoid synthesis pathways. In previous research, Members of the CYP76 gene family may play a role in subsequent modifications of furan ring synthase and oxidation of monoterpenols, which could be crucial for the synthesis of EK and DEK. Thus, phylogenetic and DEG analyses were performed to identify potential biosynthetic genes for DEK and rosefuran, focusing on CYP76 subfamilies. This study identified candidate genes potentially involved in the biosynthesis of rosefuran and dehydroelsholtzia ketone. It is anticipated that future functional validation using systems such as VIGS (virus-induced gene silencing) or CRISPR-Cas9 will enable elucidation of the EK biosynthetic process at the molecular level.

사사: 본 연구는 대한민국 정부(과학기술정보통신부, MSIT)와 한국연구재단(NRF)의 연구비 지원을 받아 수행된 연구임(RS-2024-00343723).